Diagnóstico molecular: una alternativa para la detección de patógenos en alimentos

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) se definen, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), como todas aquellas sintomatologías producidas por la ingesta de agua o alimentos contaminados con agentes químicos o microbiológicos y en algunos casos originadas por la alteración de sus propiedades físicas. Por ejemplo, los productos de origen animal, vegetal, fuentes de agua y alimentos listos para consumo, constituyen uno de los principales causantes de ETA, debido a que representan una forma fácil y nutritiva para los consumidores. Durante la producción, esta materia prima es sometida a diferentes procesos térmicos muy cortos y un alto grado de manipulación, actividades que se convierten en un riesgo potencial para la salud pública al tener gran probabilidad de adquirir patógenos durante la preparación; otra causa muy conocida de ETA es la contaminación fecal del agua utilizada para el riego o procesamiento de los productos frescos. 

Detección de patógenos en alimentos por métodos de diagnóstico convencional

Esto implica varias etapas y en muchos casos son eficaces y con bajos costos, sin embargo, presentan la desventaja de aportar resultados en días o semanas, ser laboriosos en algunos casos y sólo permiten la identificación de género y en pocos casos la especie. Pese a esto, en los últimos años se han implementado diferentes métodos de detección de patógenos en alimentos basado en el análisis por medio de espectrofotometría, detección de ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico ADN y ácido ribonucleico ARN) y biosensores, los cuales aportan alta sensibilidad y especificidad en períodos cortos de procesamiento, eliminan las limitaciones de los métodos convencionales para la detección e identificación de patógenos transmitidos por los alimentos, ahorran mano de obra y reducen errores humanos, al contar con un proceso automatizado; sin embargo, cada uno de estos métodos presenta sus propias ventajas y limitaciones.

 

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Diagnóstico convencional

La microbiología tradicional hace uso de diferentes métodos para el diagnóstico de detección de patógenos, como el pre enriquecimiento, aislamiento en medios selectivos, identificación bioquímica y, en algunos casos, caracterización antigénica; el aislamiento e identificación bacteriana se realiza en medios de cultivo partiendo de diluciones seriadas, según el alimento y los posibles microorganismos presentes en la muestra que se va a analizar. Según el alimento a examinar se realizan pruebas complementarias para la identificación de microorganismos como Staphylococcus Aureus (indicador de contaminación por manipuladores), Salmonella spp. Listeria monocytogenes; los métodos de identificación de microorganismos exigentes como los mencionados anteriormente, requieren demasiado tiempo además de la baja sensibilidad y especificidad al basarse únicamente en aspectos físicos y el costo elevado por la necesidad del uso de cantidades considerables de insumos de laboratorio. 

Pruebas inmunológicas 

Las técnicas inmunológicas se basan en la interacción entre un antígeno presente en el alimento y los anticuerpos (Ac`s) específicos policlonales o monoclonales incluidos en el Test de detección; a lo largo del tiempo se ha elaborado gran variedad de Ac`s para detectar patógenos transmitidos por los alimentos y las toxinas microbianaspor medio de diferentes tipos de ensayo.

Técnicas con Espectrometría de masas MALDI-TOF MS

La técnica de MALDI-TOF MS (Matrix assisted laser desorption ionization – time of flight – mass spectrometry), es una alternativa muy fiable para la detección de microorganismos, a partir del análisis de las proteínas principalmente ribosomales (2-20 KDa), por medio de la creación de un espectro de masas específico para cada género y especie(33). MALDI-TOF MS se ha empleado para la detección de diversos microorganismos en alimentos como fuente de investigación diferentes tipos de ensayo.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico molecular de los diferentes patógenos en alimentos, fue desarrollada hace más de 30 años con el fin de amplificar secuencias de ADN cromosómico y plasmídico específico de cada microorganismo para obtener millones de copias.

Microarrays

Los microarrays presentan un gran potencial para su uso en el diagnóstico, debido a la capacidad de analizar simultáneamente un gran número de secuencias de ácidos nucleicos y la detección de múltiples dianas genéticas o genomas de múltiples patógenos en un solo montaje, diferenciando los microorganismos que presentan una marcada similitud entre sí; un microarrays debidamente diseñado es capaz de identificar los genes asociados a los factores de virulencia y a la resistencia a antibióticos.

Pirosecuenciación 

Esta técnica fue elaborada por Mostaza Ronaghi y colaboradores a finales de los años 90, como una variante de la secuenciación de alto rendimiento de segunda generación, con el fin de aumentar el rendimiento y disminuir su costo; hoy en día su aplicación se basa en el análisis de agua potable, mutaciones de microorganismos de interés clínico, resistencia genética, transferencia de genes y detección de patógenos en alimentos.

A Continuación, a mayor detalle ventajas y limitaciones de las técnicas moleculares.

Técnicas	Ventajas	Limitaciones
PCR simple	Mayor rapidez (4-24 h Vs 5-7 días). Alta especificidad y sensibilidad.  Automatizado.	Inhibidores de PCR. Requiere purificación de ADN.  Alto costo.
PCR Tiempo Real	Específica y sensible.  Amplificación monitoreada en tiempo real.  Ciclos rápidos. Reproducible.  No requiere de post-procesamiento de los productos de amplificación.	Alto costo. Inhibidores de la PCR.  Requiere personal capacitado.  La contaminación cruzada.
Microarreglos	Rapidez.  Análisis múltiple. Alta sensibilidad y especificidad.  Caracterización de cada cepa.	Requiere kits o PCR para marcar los genes blancos. Alto costo.  Pocas plataformas para estudio de patógenos en alimentos.
Biosensores	Alta selectividad y sensibilidad.  Automatizables y miniaturizados. Reproducibilidad, velocidad en el análisis y ejecución en tiempo real.  Análisis múltiple de patógenos en alimentos perecederos y semiperecederos.  Permite la existencia de varias configuraciones por la diversidad de las propiedades transductoras.  Larga vida útil de los dispositivos (materiales estables y resistentes).  En la mayoría de los casos es innecesario el pre-tratamiento de las muestras.	Ciertos biosensores pueden requerir extensos y pretratamiento de las muestras.  Existen pocas plataformas de biosensores individuales, disponibles comercialmente.
Pirosecuenciación	Sensible, específica y precisa. Secuenciación sin electroforesis. Rápido (7-10 h).  Se realiza en tiempo real.  Costos de reactivos más bajos en comparación con otros métodos de secuenciación.	No hay detección de células viables sin pre-enriquecimiento. Las muestras necesitan estar preparadas y amplificadas. Bioinformática compleja.  Alto costo inicial del equipamiento.
Electroforesis en gel de campo pulsado	Mayor poder de separación (separa moléculas inferiores a 50 Kb sin distorsión y hasta moléculas de 2 Mb). Los carriles electroforéticos son perfectamente rectilíneos y el patrón de separación es independiente de la posición del gel	Asignación de bandas anormales para la interpretación de perfiles estrechamente relacionados.

Fuente: Universidad de Boyacá. Facultad de Ciencias de la Salud

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